vetpressАграрная наукаAgrarian science0869-81552686-701XРедакция журнала "Аграрная наука"10.32634/0869-8155-2025-394-05-89-94vetpress-3625Research ArticleЗООТЕХНИЯZOOTECHNICSДНК-технологии идентификации аллелей и генотипов полиморфных маркеров анализируемого локуса гена iNOS Bos taurusDNA technologies for identification of alleles and genotypes of polymorphic markers of the analyzed locus of the Bos taurus iNOS genehttps://orcid.org/0000-0003-0914-0053ВафинР. Р.VafinR. R.

Рамиль Ришадович Вафин, доктор биологических наук, профессор РАН, научный консультант

Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428

Ramil Rishadovich Vafin, Doctor of Biological Sciences, Professor of RAS, Scientific Consultant

24 Ryazan Ave., Moscow, 109428

vafin-ramil@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7053-6925ГильмановХ. Х.GilmanovKh. Kh.

Хамид Халимович Гильманов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428

Khamid Khalimovich Gilmanov, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher

24 Ryazan Ave., Moscow, 109428

gilmanov.xx@mail.ruФедеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАНРоссияFederal Scientific Centre VIEVRussian Federation202516052025058994Copyright © Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х., 20252025Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х.Vafin R.R., Gilmanov K.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vetpress.ru/jour/article/view/3625

Актуальной областью исследования генетико-селекционной направленности, в долгосрочной перспективе необходимой для воспроизводства высокопродуктивного стада крупного рогатого скота с генетической устойчивостью к лейкозу, является изучение полиморфизма гена iNOS Bos taurus в ассоциативной связи с племенной ценностью животных и их резистентностью к указанному хроническому инфекционному заболеванию.

Цель  настоящего  исследования заключалась в разработке ДНК-технологий идентификации аллелей и генотипов SNP-маркеров гена iNOS  Bos  taurus детекцией и интерпретацией диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов на основе смоделированных способов проведения вложенной ПЦР с dCAPS-праймерами и SNP-генотипирования анализом данных прямого секвенирования ПЦР-продукта. Конструирование dCAPS праймеров iNOS-F1 и iNOS-R1 выполнено с использованием программного обеспечения dCAPS Finder 2.0 и OligoAnalyzer 1.2. Картирование полиморфных сайтов рестрикции и расчет ПЦР-ПДРФ-профилей возможных генотипов SNP-маркеров осуществлены с применением онлайн-программы NEBcutter V2.0. Сконструированные dCAPS-праймеры успешно протестированы при постановке вложенной ПЦР в статусе внутренних пар олигонуклеотидов с последующей процедурой эндонуклеазного расщепления амплификата 2-го раунда ПЦР длиной 123 bp подобранными рестриктазами, идентификационно значимыми для определенного полиморфного маркера. Амплификат 1-го раунда ПЦР длиной 258 bp был подвергнут капиллярному секвенированию ДНК по Сэнгеру для детекции и интерпретации диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов в контексте идентификации аллелей и генотипов SNP-маркеров. ДНК-технологии, использованные в данной работе, оказались действенными подходами к корректному генотипированию крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS.

The current area of research in genetic and selection focus, which is necessary in the long term for the reproduction of a highly productive herd of cattle with genetic resistance to leukemia, is the study of the polymorphism of the Bos taurus iNOS gene of in association with the breeding value of animals and their resistance to this chronic infectious disease. The aim of.this study was to develop DNA technologies for identification of alleles and genotypes of SNP markers of the Bos taurus iNOS gene by detection and interpretation of diagnostically significant single nucleotide polymorphisms based on simulated methods of nested PCR with dCAPS primers and SNP genotyping by analysis of direct sequencing data of the PCR product. Construction of dCAPS primers iNOS-F1 and iNOS-R1 was performed using dCAPS Finder 2.0 and OligoAnalyzer 1.2 software. Mapping of polymorphic restriction sites and calculation of PCR-RFLP profiles of possible genotypes of SNP markers were performed using the NEBcutter V2.0 online program. The constructed dCAPS primers were successfully tested in nested PCR as internal oligonucleotide pairs followed by endonuclease digestion of the 123 bp PCR amplification product of the second round with selected restriction enzymes that were significant for identification of a particular polymorphic marker. The 258 bp PCR amplification product of the first round was subjected to capillary DNA sequencing according to Sanger for detection and interpretation of diagnostically significant single nucleotide polymorphisms in the context of identification of alleles and genotypes of SNP markers. The DNA technologies used in this work turned out to be effective approaches to correct genotyping of cattle by SNP markers of the iNOS gene.

iNOSBos taurusSNP-маркерыПЦРПДРФсеквенированиегенотипированиеiNOSBos taurusSNP markersPCRRFLPsequencinggenotypingИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-76-10011. https://rscf.ru/project/22-76-10011/This research was funded by Russian Science Foundation No. 22-76-10011. https://rscf.ru/project/22-76-10011/ReferencesZhang W. et al. Nitric oxide synthase and its function in animal reproduction: an update. Frontiers in Physiology. 2023; 14: 1288669. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1288669Zhang W. et al. Nitric oxide synthase and its function in animal reproduction: an update. Frontiers in Physiology. 2023; 14: 1288669. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1288669Lemal P., May K., König S., Schroyen M., Gengler N. Invited review: From heat stress to disease — Immune response and candidate genes involved in cattle thermotolerance. Journal of Dairy Science. 2023; 106(7): 4471‒4488. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22727Lemal P., May K., König S., Schroyen M., Gengler N. Invited review: From heat stress to disease — Immune response and candidate genes involved in cattle thermotolerance. Journal of Dairy Science. 2023; 106(7): 4471‒4488. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22727Ohhashi T., Kawai Y., Maejima D., Hayashi M., Watanabe-Asaka T. Physiological roles of lymph flow-mediated nitric oxide in lymphatic system. Lymphatic Research and Biology. 2023; 21(3): 253‒261.Ohhashi T., Kawai Y., Maejima D., Hayashi M., Watanabe-Asaka T. Physiological roles of lymph flow-mediated nitric oxide in lymphatic system. Lymphatic Research and Biology. 2023; 21(3): 253‒261.Chakravortty D., Hense M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. Microbes and Infection. 2003; 5(7): 621‒627. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(03)00096-0Chakravortty D., Hense M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. Microbes and Infection. 2003; 5(7): 621‒627. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(03)00096-0Bogdan C., Röllinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Current Opinion in Immunology. 2000; 12(1): 64‒76. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(99)00052-7Bogdan C., Röllinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Current Opinion in Immunology. 2000; 12(1): 64‒76. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(99)00052-7Beishova I.S. et al. Genetic polymorphism of prolactin and nitric oxide synthase in Holstein cattle. Veterinary World. 2023; 16(1): 161‒167. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.161-167 7. Wang M., Ibeagha-Awemu E.M. Impacts of Epigenetic Processes on the Health and Productivity of Livestock. Frontiers in Genetics. 2021; 11: 613636. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.613636Beishova I.S. et al. Genetic polymorphism of prolactin and nitric oxide synthase in Holstein cattle. Veterinary World. 2023; 16(1): 161‒167. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.161-167Чичинина С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Новосибирск. 2005; 110. https://www.elibrary.ru/nnhnwbWang M., Ibeagha-Awemu E.M. Impacts of Epigenetic Processes on the Health and Productivity of Livestock. Frontiers in Genetics. 2021; 11: 613636. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.613636Kocaman B., Toy S., Maraklı S. Application of different molecular markers in biotechnology. International Journal of Science Letters. 2020; 2(2); 98‒113. https://doi.org/10.38058/ijsl.770081Chichinina S.V. The role of allelic variability of cytokine genes in the formation of cattle resistance to leukemia. PhD (Biology) Thesis. Novosibirsk. 2005; 110 (in Russian). https://www.elibrary.ru/nnhnwbHashim H.O., Al-Shuhaib M.B.S. Exploring the Potential and Limitations of PCR-RFLP and PCR-SSCP for SNP Detection: a Review. Journal of Applied Biotechnology Reports. 2019; 6(4): 137‒144. https://doi.org/10.29252/JABR.06.04.02Kocaman B., Toy S., Maraklı S. Application of different molecular markers in biotechnology. International Journal of Science Letters. 2020; 2(2); 98‒113. https://doi.org/10.38058/ijsl.770081Ota M., Fukushima H., Kulski J.K., Inoko H. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2007; 2(11): 2857– 2864. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.407Hashim H.O., Al-Shuhaib M.B.S. Exploring the Potential and Limitations of PCR-RFLP and PCR-SSCP for SNP Detection: a Review. Journal of Applied Biotechnology Reports. 2019; 6(4): 137‒144. https://doi.org/10.29252/JABR.06.04.02Гильманов Х.Х., Вафин Р.Р., Каримова Р.Г., Тюлькин С.В. Способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам полиморфного маркера AH13-1 гена iNOS. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2018; (4): 22‒28. https://www.elibrary.ru/urlbzlOta M., Fukushima H., Kulski J.K., Inoko H. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2007; 2(11): 2857– 2864. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.407Kuzhebaeva U.Zh., Donnik I.M., Petropavlovsky M.V., Kanatbaev S.G., Nurgaliev B.E. Nitric oxide as an indicator for assessing the resistance and susceptibility of cattle to leukemia. Agrarian Bulletin of the Urals. 2021; (10): 48‒54. https://doi.org/10.32417/1997-4868-2021-213-10-48-54Gilmanov Kh.Kh., Vafin R.R., Karimova R.G., Tyulkin S.V. Method of carrying out PCR-RFLP for cattle genotyping on allelic variants of polymorphic marker of iNOS gene. Veterinary, Zootechnics and Biotechnology. 2018; (4): 22‒28 (in Russian). https://www.elibrary.ru/urlbzlВафин Р.Р., Гильманов Х.Х., Шастин П.Н. Тестирование разработанного способа ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS. Аграрная наука. 2024; (7): 74‒77. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2024-384-7-74-78Kuzhebaeva U.Zh., Donnik I.M., Petropavlovsky M.V., Kanatbaev S.G., Nurgaliev B.E. Nitric oxide as an indicator for assessing the resistance and susceptibility of cattle to leukemia. Agrarian Bulletin of the Urals. 2021; (10): 48‒54. https://doi.org/10.32417/1997-4868-2021-213-10-48-54Hrubá M. dCAPS method: advantages, troubles and solution. Plant, Soil and Environment. 2007; 53(9): 417‒420. https://doi.org/10.17221/2293-PSEVafin R.R., Gilmanov Kh.Kh., Shastin P.N. Testing of the developed method for PCR-RFLP genotyping of cattle using SNP markers of the iNOS gene. Agrarian science. 2024; (7): 74‒78 (in Russian). https://doi.org/10.32634/0869-8155-2024-384-7-74-78Shendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286Hrubá M. dCAPS method: advantages, troubles and solution. Plant, Soil and Environment. 2007; 53(9): 417‒420. https://doi.org/10.17221/2293-PSEShendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286Shendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286

The authors declare that there are no conflicts of interest present.