vetpressАграрная наукаAgrarian science0869-81552686-701XРедакция журнала "Аграрная наука"10.32634/0869-8155-2025-397-08-58-63vetpress-3788Research ArticleЗООТЕХНИЯZOOTECHNICSСпособы проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по анализируемым SNP-маркерам гена iNOSMethods of conducting real-time PCR for genotyping cattle by analyzed SNP markers of the iNOS genehttps://orcid.org/0000-0003-0914-0053ВафинР. Р.VafinR. R.

Рамиль Ришадович Вафин, доктор биологических наук, профессор РАН, научный консультант 

Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428

Ramil Rishadovich Vafin, Doctor of Biological Sciences, Professor of RAS, Scientific Consultant 

24 Ryazan Ave., Moscow, 109428

vafin-ramil@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-7053-6925ГильмановХ. Х.GilmanovKh. Kh.

Хамид Халимович Гильманов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник 

Рязанский пр-т, 24, Москва, 109428

Khamid Khalimovich Gilmanov, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher 

24 Ryazan Ave., Moscow, 109428

gilmanov.xx@mail.ruФедеральный научный центр — Всероссийский научноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наукРоссияFederal State Budget Scientific Institution “Federal Scientific Centre VIEV”Russian Federation202502092025085863Copyright © Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х., 20252025Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х.Vafin R.R., Gilmanov K.K.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vetpress.ru/jour/article/view/3788

Современное развитие генетико-селекционных технологий требует углубленного изучения молекулярно-генетических механизмов, определяющих устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу. В этом контексте исследование полиморфизма гена iNOS Bos taurus представляет особую научную и практическую значимость, поскольку его результаты могут быть использованы для совершенствования селекционных программ, направленных на повышение как продуктивности животных, так и их резистентности к хроническим инфекционным заболеваниям. Цель настоящего исследования — разработка способов проведения ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции однонуклеотидных полиморфизмов для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 гена iNOS. Дизайн модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов, формирующих для определенного полиморфного маркера свой набор из 5′-флуоресцентно-меченых аллель-специфических праймеров, анти-праймера, меченого гасителем флуоресценции с 3′-конца олигонуклеотида, а также общего праймера, выполнен в программе OligoAnalyzer 1.2. Разработанные способы, протестированные в данной работе, относятся к разновидности анти-праймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени, гибридизационно-флуоресцентный формат детекции которой обеспечивает корректную интерпретацию данных кривых роста сигнала флуоресценции. Их достоверность подкреплена ПЦР-ПДРФ-анализом с подобранными праймерами и эндонуклеазами рестрикции, тоже способными к идентификации генотипов искомых SNP-маркеров. При этом предложенные способы проведения ПЦР в реальном времени по сравнению с ПЦР-ПДРФ-анализом более экспрессны, так как не требуют времязатратных процедур эндонуклеазного расщепления и последующего электрофоретического разделения генерируемых фрагментов.

Modern development of genetic and selection technologies requires in-depth study of molecular genetic mechanisms determining cattle resistance to leukemia. In this context, the study of the iNOS gene polymorphism in Bos taurus is of particular scientific and practical importance, since its results can be used to improve breeding programs aimed at increasing both animal productivity and their resistance to chronic infectious diseases. The aim of this study was to develop methods for real-time PCR in the format of hybridization-fluorescence detection of single nucleotide polymorphisms for genotyping cattle by SNP markers AH13-1 and AH13-6 of the iNOS gene. The design of modified and unmodified oligonucleotides forming for a certain polymorphic marker their own set of 5′-fluorescently labeled allele-specific primers, an anti-primer labeled with a fluorescence quencher from the 3′-end of the oligonucleotide, and a common primer was performed in the OligoAnalyzer 1.2 program. The developed methods tested in this work belong to a variety of anti-primer-mediated quantitative real-time PCR, the hybridization-fluorescence detection format of which ensures correct interpretation of the fluorescence signal growth curve data. Their reliability is supported by PCR-RFLP analysis with selected primers and restriction endonucleases, which are also capable of identifying the genotypes of the sought SNP markers. Moreover, the proposed methods for conducting real-time PCR are more expressive compared to PCR-RFLP analysis, since they do not require time-consuming procedures of endonuclease cleavage and subsequent electrophoretic separation of the generated fragments.

iNOSBos taurusSNP-маркерыПЦРПДРФгенотипированиеiNOSBos taurusSNP markersPCRRFLPgenotypingИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-76-10011. https://rscf.ru/project/22-76-10011/This research was funded by Russian Science Foundation No. 22-76-10011. https://rscf.ru/project/22-76-10011/ReferencesLemal P., May K., König S., Schroyen M., Gengler N. Invited review: From heat stress to disease — Immune response and candidate genes involved in cattle thermotolerance. Journal of Dairy Science. 2023; 106(7): 4471‒4488. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22727Lemal P., May K., König S., Schroyen M., Gengler N. Invited review: From heat stress to disease — Immune response and candidate genes involved in cattle thermotolerance. Journal of Dairy Science. 2023; 106(7): 4471‒4488. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22727Zhang W. et al. Nitric oxide synthase and its function in animal reproduction: an update. Frontiers in Physiology. 2023; 14: 1288669. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1288669Zhang W. et al. Nitric oxide synthase and its function in animal reproduction: an update. Frontiers in Physiology. 2023; 14: 1288669. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1288669Ohhashi T., Kawai Y., Maejima D., Hayashi M., Watanabe-Asaka T. Physiological Roles of Lymph Flow-Mediated Nitric Oxide in Lymphatic System. Lymphatic Research and Biology. 2023; 21(3): 253‒261.Ohhashi T., Kawai Y., Maejima D., Hayashi M., Watanabe-Asaka T. Physiological Roles of Lymph Flow-Mediated Nitric Oxide in Lymphatic System. Lymphatic Research and Biology. 2023; 21(3): 253‒261.Chakravortty D., Hense M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. Microbes and Infection. 2003; 5(7): 621‒627. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(03)00096-0Chakravortty D., Hense M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. Microbes and Infection. 2003; 5(7): 621‒627. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(03)00096-0Bogdan C., Röllinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Current Opinion in Immunology. 2000; 12(1): 64‒76. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(99)00052-7Bogdan C., Röllinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Current Opinion in Immunology. 2000; 12(1): 64‒76. https://doi.org/10.1Beishova I.S. et al. Genetic polymorphism of prolactin and nitric oxide synthase in Holstein cattle. Veterinary World. 2023; 16(1): 161‒167. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.161-167Beishova I.S. et al. Genetic polymorphism of prolactin and nitric oxide synthase in Holstein cattle. Veterinary World. 2023; 16(1): 161‒167. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.161-167Wang M., Ibeagha-Awemu E.M. Impacts of Epigenetic Processes on the Health and Productivity of Livestock. Frontiers in Genetics. 2021; 11: 613636. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.613636Wang M., Ibeagha-Awemu E.M. Impacts of Epigenetic Processes on the Health and Productivity of Livestock. Frontiers in Genetics. 2021; 11: 613636. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.613636Чичинина С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Новосибирск. 2005; 110. https://www.elibrary.ru/nnhnwbChichinina S.V. The role of allelic variability of cytokine genes in the formation of cattle resistance to leukemia. Dissertation for the degree of candidate of biological sciences. Novosibirsk. 2005; 110 (in Russian). https://www.elibrary.ru/nnhnwbKocaman B., Toy S., Maraklı S. Application of different molecular markers in biotechnology. International Journal of Science Letters. 2020; 2(2); 98‒113. https://doi.org/10.38058/ijsl.770081Kocaman B., Toy S., Maraklı S. Application of different molecular markers in biotechnology. International Journal of Science Letters. 2020; 2(2); 98‒113. https://doi.org/10.38058/ijsl.770081Hashim H.O., Al-Shuhaib M.B.S. Exploring the Potential and Limitations of PCR-RFLP and PCR-SSCP for SNP Detection: A Review. Journal of Applied Biotechnology Reports. 2019; 6(4): 137‒144. https://doi.org/10.29252/JABR.06.04.02Hashim H.O., Al-Shuhaib M.B.S. Exploring the Potential and Limitations of PCR-RFLP and PCR-SSCP for SNP Detection: A Review. Journal of Applied Biotechnology Reports. 2019; 6(4): 137‒144. https://doi.org/10.29252/JABR.06.04.02Ota M., Fukushima H., Kulski J.K., Inoko H. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2007; 2(11): 2857–2864. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.407Ota M., Fukushima H., Kulski J.K., Inoko H. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2007; 2(11): 2857–2864. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.407Kuzhebaeva U.Zh., Donnik I.M., Petropavlovskiy M.V., Kanatbaev S.G., Nurgaliev B.E. Nitric oxide as an indicator for assessing the resistance and susceptibility of cattle to leukemia. Аграрный вестник Урала. 2021; (10): 48–54. https://doi.org/10.32417/1997-4868-2021-213-10-48-54Kuzhebaeva U.Zh., Donnik I.M., Petropavlovskiy M.V., Kanatbaev S.G., Nurgaliev B.E. Nitric oxide as an indicator for assessing the resistance and susceptibility of cattle to leukemia. Agrarian Bulletin of the Urals. 2021; (10): 48–54. https://doi.org/10.32417/1997-4868-2021-213-10-48-54Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х., Шастин П.Н. Тестирование разработанного способа ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS. Аграрная наука. 2024; (7): 74‒78. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2024-384-7-74-78Vafin R.R., Gilmanov Kh.Kh., Shastin P.N. Testing of the developed method for PCR-RFLP genotyping of cattle using SNP markers of the iNOS gene. Agrarian science. 2024; (7): 74‒78 (in Russian). https://doi.org/10.32634/0869-8155-2024-384-7-74-78Hrubá M. dCAPS method: advantages, troubles and solution. Plant, Soil and Environment. 2007; 53(9): 417‒420. https://doi.org/10.17221/2293-PSEHrubá M. dCAPS method: advantages, troubles and solution. Plant, Soil and Environment. 2007; 53(9): 417‒420. https://doi.org/10.17221/2293-PSEShendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286Shendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286Li J., Makrigiorgos G.M. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping. Nature Protocols. 2007; 2(1): 50‒58. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.11Li J., Makrigiorgos G.M. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping. Nature Protocols. 2007; 2(1): 50‒58. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.11Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х. ДНК-технологии идентификации аллелей и генотипов полиморфных маркеров анализируемого локуса гена iNOS Bos taurus. Аграрная наука. 2025; (5): 89‒94. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2025-394-05-89-94Vafin R.R., Gilmanov Kh.Kh. DNA technologies for identification of alleles and genotypes of polymorphic markers of the analyzed locus of the Bos taurus iNOS gene. Agrarian science. 2025; (5): 89‒94 (in Russian). https://doi.org/10.32634/0869-8155-2025-394-05-89-94

The authors declare that there are no conflicts of interest present.