ДНК-технологии идентификации аллелей и генотипов полиморфных маркеров анализируемого локуса гена iNOS Bos taurus

Актуальной областью исследования генетико-селекционной направленности, в долгосрочной перспективе необходимой для воспроизводства высокопродуктивного стада крупного рогатого скота с генетической устойчивостью к лейкозу, является изучение полиморфизма гена iNOS Bos taurus в ассоциативной связи с племенной ценностью животных и их резистентностью к указанному хроническому инфекционному заболеванию.

Цель  настоящего  исследования заключалась в разработке ДНК-технологий идентификации аллелей и генотипов SNP-маркеров гена iNOS  Bos  taurus детекцией и интерпретацией диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов на основе смоделированных способов проведения вложенной ПЦР с dCAPS-праймерами и SNP-генотипирования анализом данных прямого секвенирования ПЦР-продукта. Конструирование dCAPS праймеров iNOS-F1 и iNOS-R1 выполнено с использованием программного обеспечения dCAPS Finder 2.0 и OligoAnalyzer 1.2. Картирование полиморфных сайтов рестрикции и расчет ПЦР-ПДРФ-профилей возможных генотипов SNP-маркеров осуществлены с применением онлайн-программы NEBcutter V2.0. Сконструированные dCAPS-праймеры успешно протестированы при постановке вложенной ПЦР в статусе внутренних пар олигонуклеотидов с последующей процедурой эндонуклеазного расщепления амплификата 2-го раунда ПЦР длиной 123 bp подобранными рестриктазами, идентификационно значимыми для определенного полиморфного маркера. Амплификат 1-го раунда ПЦР длиной 258 bp был подвергнут капиллярному секвенированию ДНК по Сэнгеру для детекции и интерпретации диагностически значимых однонуклеотидных полиморфизмов в контексте идентификации аллелей и генотипов SNP-маркеров. ДНК-технологии, использованные в данной работе, оказались действенными подходами к корректному генотипированию крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS.

1. Zhang W. et al. Nitric oxide synthase and its function in animal reproduction: an update. Frontiers in Physiology. 2023; 14: 1288669. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1288669

2. Lemal P., May K., König S., Schroyen M., Gengler N. Invited review: From heat stress to disease — Immune response and candidate genes involved in cattle thermotolerance. Journal of Dairy Science. 2023; 106(7): 4471‒4488. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22727

3. Ohhashi T., Kawai Y., Maejima D., Hayashi M., Watanabe-Asaka T. Physiological roles of lymph flow-mediated nitric oxide in lymphatic system. Lymphatic Research and Biology. 2023; 21(3): 253‒261.

4. Chakravortty D., Hense M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. Microbes and Infection. 2003; 5(7): 621‒627. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(03)00096-0

5. Bogdan C., Röllinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Current Opinion in Immunology. 2000; 12(1): 64‒76. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(99)00052-7

6. Beishova I.S. et al. Genetic polymorphism of prolactin and nitric oxide synthase in Holstein cattle. Veterinary World. 2023; 16(1): 161‒167. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.161-167 7. Wang M., Ibeagha-Awemu E.M. Impacts of Epigenetic Processes on the Health and Productivity of Livestock. Frontiers in Genetics. 2021; 11: 613636. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.613636

7. Чичинина С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Новосибирск. 2005; 110. https://www.elibrary.ru/nnhnwb

8. Kocaman B., Toy S., Maraklı S. Application of different molecular markers in biotechnology. International Journal of Science Letters. 2020; 2(2); 98‒113. https://doi.org/10.38058/ijsl.770081

9. Hashim H.O., Al-Shuhaib M.B.S. Exploring the Potential and Limitations of PCR-RFLP and PCR-SSCP for SNP Detection: a Review. Journal of Applied Biotechnology Reports. 2019; 6(4): 137‒144. https://doi.org/10.29252/JABR.06.04.02

10. Ota M., Fukushima H., Kulski J.K., Inoko H. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2007; 2(11): 2857– 2864. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.407

11. Гильманов Х.Х., Вафин Р.Р., Каримова Р.Г., Тюлькин С.В. Способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллельным вариантам полиморфного маркера AH13-1 гена iNOS. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2018; (4): 22‒28. https://www.elibrary.ru/urlbzl

12. Kuzhebaeva U.Zh., Donnik I.M., Petropavlovsky M.V., Kanatbaev S.G., Nurgaliev B.E. Nitric oxide as an indicator for assessing the resistance and susceptibility of cattle to leukemia. Agrarian Bulletin of the Urals. 2021; (10): 48‒54. https://doi.org/10.32417/1997-4868-2021-213-10-48-54

13. Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х., Шастин П.Н. Тестирование разработанного способа ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS. Аграрная наука. 2024; (7): 74‒77. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2024-384-7-74-78

14. Hrubá M. dCAPS method: advantages, troubles and solution. Plant, Soil and Environment. 2007; 53(9): 417‒420. https://doi.org/10.17221/2293-PSE

15. Shendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286