Оптимизация условий культивирования соматических клеток и оценка их состояния при клонировании эмбрионов крупного рогатого скота методом «ручного» клонирования

Представлены результаты оптимизации условий культивирования соматических клеток при клонировании эмбрионов крупного рогатого скота методом Handmade cloning (HMC). Изучено влияние состава среды, номера пассажа фибробластов и трихостатина А (ТСА) на морфокинетику реконструированных эмбрионов. Использование среды DMEM/F12 обеспечивало больший диаметр бластоцист по сравнению с α-MEM при сопоставимом выходе по числу эмбрионов, развившихся до этой стадии. Оптимальным оказался пятый пассаж фибробластов, при котором выход бластоцист достигал 49,1%. Добавление 40 нМ ТСА к схеме культивирования повышало общую эффективность примерно в 1,6 раза: выход бластоцист увеличивался с 37,2% до 59,3%, средний диаметр возрастал на 14,9%, а эмбриональная смертность на переходе морула–бластоциста снижалась с 20% до 5%. Разработанный протокол (DMEM/F12, пятый пассаж, 40 нМ ТСА) обеспечивает стандартизированное получение бластоцист КРС методом HMC с эффективностью не ниже 59% и средним диаметром 184,4 мкм (при использовании ТСА) и до 199,5 мкм (в среде DMEM/F12). Именно такая комбинация параметров наиболее чутко отражает изменение условий культивирования и может быть использована как рабочий стандарт для дальнейших исследований.

1. Vajta G., Lewis I.M., Hyttel P., Thouas G.A., Trounson A.O. Somatic Cell Cloning without Micromanipulators. Cellular Reprogramming. 2001; 3(2): 89–95. https://doi.org/10.1089/15204550152475590

2. Vajta G. Handmade cloning: the future way of nuclear transfer?. Trends in Biotechnology. 2007; 25(6): 250–253. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2007.04.004

3. Booth P.J., Tan S.J., Reipurth R., Holm P., Callesen H. Simplification of Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer by Application of a Zona-Free Manipulation Technique. Cellular Reprogramming. 2001; 3(3): 139–150. https://doi.org/10.1089/153623001753205098

4. Du Y. et al. Piglets born from handmade cloning, an innovative cloning method without micromanipulation. Theriogenology. 2007; 68(8): 1104–1110. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2007.07.021

5. Kishigami S. et al. Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006; 340(1): 183–189. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2005.11.164

6. Lee S.-C. et al. Trichostatin A-Induced Epigenetic Modifications and Their Influence on the Development of Porcine Cloned Embryos Derived from Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 2025; 26(5): 2359. https://doi.org/10.3390/ijms26052359

7. Niemann H. Epigenetic reprogramming in mammalian species after SCNTbased cloning. Theriogenology. 2016; 86(1): 80–90. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.04.021

8. Ogura A., Inoue K., Wakayama T. Recent advancements in cloning by somatic cell nuclear transfer. Philosophical Transactions of the Royal Society B. Biological sciences. 2013; 368(1609): 20110329. https://doi.org/10.1098/rstb.2011.0329

9. Selokar N.L. et al. Effect of post-fusion holding time, orientation and position of somatic cell-cytoplasts during electrofusion on the development of handmade cloned embryos in buffalo (Bubalus bubalis). Theriogenology. 2012; 78(4): 930–936. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2012.03.018

10. Khan S. et al. Comparison of efficiency of in vitro cloned sheep embryo production by conventional somatic cell nuclear transfer and handmade cloning technique. Reproduction in Domestic Animals. 2018; 53(2): 512–518. https://doi.org/10.1111/rda.13138

11. Lee M.-J. et al. Trichostatin A Promotes the Development of Bovine Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos. Journal of Reproduction and Development. 2011; 57(1): 34–42. https://doi.org/10.1262/jrd.10-012a

12. Zhe X. et al. Chemical reprogramming regulates Tip60 expression to improve cleavage rates in somatic cell nuclear transfer reconstituted embryos of cashmere goats. Frontiers in Veterinary Science. 2025; 12: 1720533. https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1720533

13. Cole L., Diaz S., Lorch W., Burroughs D., Crosier D. Skill: Practice Skin Biopsy at Home. The Ohio State University College of Veterinary Medicine. OSU CVM Veterinary Clinical and Professional Skills Center Handbook. Columbus, Ohio: The Ohio State University College of Veterinary Medicine. 2018. https://ohiostate.pressbooks.pub/osuvcpslhandbook/chapter/derm_exam-basictechs_goal-seven-alt/

14. Семенова Е.И. и др. Клонирование КРС технологией HMC: преимущества метода, достижения. Эффективное животноводство. 2025; (1): 12–13. https://doi.org/10.24412/cl-33489-2025-1-12-13

15. Кириенко К.В. и др. Апробация прогрессивной технологии клонирования крупного рогатого скота. Проблемы биологии продуктивных животных. 2024; (2): 31–44. https://doi.org/10.25687/1996-6733.prodanimbiol.2024.2.31-44

16. Herrid M., Van Eenennaam A. Application of zona-free cloning technologies to livestock breeding programmes. Animal Reproduction Science. 2026; 287: 108107. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2026.108107

17. Скорлупкина, Н. Н. и др. Сравнительное исследование культурального масла, используемого на эмбриологическом этапе программ лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2024; 8: 121-126. https://doi.org/10.18565/aig.2024.123.

18. de Aguiar L.H., Lee Y.L., Abdelhady A.W., Koganti P.P., Selvaraj V., Cheong S.H. Flexible oocyte manipulation with delayed maturation and improved somatic cell nuclear transfer efficiency using induced pluripotent stem cells. Theriogenology. 2026; 251: 117754. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2025.117754

19. Singina G.N., Lopukhov A.V., Shedova E.N., Zhukova A.S. The influence of oocyte and donor cell preparation conditions on the efficiency of somatic cloning in sheep (Ovis aries L.) Agricultural Biology. 2024; 59(4): 692-703. https://doi.org10.15389/agrobiology.2024.4.692eng