Способы проведения ПЦР в реальном времени для генотипирования крупного рогатого скота по анализируемым SNP-маркерам гена iNOS

Современное развитие генетико-селекционных технологий требует углубленного изучения молекулярно-генетических механизмов, определяющих устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу. В этом контексте исследование полиморфизма гена iNOS Bos taurus представляет особую научную и практическую значимость, поскольку его результаты могут быть использованы для совершенствования селекционных программ, направленных на повышение как продуктивности животных, так и их резистентности к хроническим инфекционным заболеваниям.
Цель настоящего исследования — разработка способов проведения ПЦР в реальном времени в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции однонуклеотидных полиморфизмов для генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам AH13-1 и AH13-6 гена iNOS.
Дизайн модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов, формирующих для определенного полиморфного маркера свой набор из 5′-флуоресцентно-меченых аллель-специфических праймеров, анти-праймера, меченого гасителем флуоресценции с 3′-конца олигонуклеотида, а также общего праймера, выполнен в программе OligoAnalyzer 1.2. Разработанные способы, протестированные в данной работе, относятся к разновидности анти-праймер-опосредованной количественной ПЦР в реальном времени, гибридизационно-флуоресцентный формат детекции которой обеспечивает корректную интерпретацию данных кривых роста сигнала флуоресценции. Их достоверность подкреплена ПЦР-ПДРФ-анализом с подобранными праймерами и эндонуклеазами рестрикции, тоже способными к идентификации генотипов искомых SNP-маркеров. При этом предложенные способы проведения ПЦР в реальном времени по сравнению с ПЦР-ПДРФ-анализом более экспрессны, так как не требуют времязатратных процедур эндонуклеазного расщепления и последующего электрофоретического разделения генерируемых фрагментов.

1. Lemal P., May K., König S., Schroyen M., Gengler N. Invited review: From heat stress to disease — Immune response and candidate genes involved in cattle thermotolerance. Journal of Dairy Science. 2023; 106(7): 4471‒4488. https://doi.org/10.3168/jds.2022-22727

2. Zhang W. et al. Nitric oxide synthase and its function in animal reproduction: an update. Frontiers in Physiology. 2023; 14: 1288669. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1288669

3. Ohhashi T., Kawai Y., Maejima D., Hayashi M., Watanabe-Asaka T. Physiological Roles of Lymph Flow-Mediated Nitric Oxide in Lymphatic System. Lymphatic Research and Biology. 2023; 21(3): 253‒261.

4. Chakravortty D., Hense M. Inducible nitric oxide synthase and control of intracellular bacterial pathogens. Microbes and Infection. 2003; 5(7): 621‒627. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(03)00096-0

5. Bogdan C., Röllinghoff M., Diefenbach A. Reactive oxygen and reactive nitrogen intermediates in innate and specific immunity. Current Opinion in Immunology. 2000; 12(1): 64‒76. https://doi.org/10.1016/s0952-7915(99)00052-7

6. Beishova I.S. et al. Genetic polymorphism of prolactin and nitric oxide synthase in Holstein cattle. Veterinary World. 2023; 16(1): 161‒167. https://doi.org/10.14202/vetworld.2023.161-167

7. Wang M., Ibeagha-Awemu E.M. Impacts of Epigenetic Processes on the Health and Productivity of Livestock. Frontiers in Genetics. 2021; 11: 613636. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.613636

8. Чичинина С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Новосибирск. 2005; 110. https://www.elibrary.ru/nnhnwb

9. Kocaman B., Toy S., Maraklı S. Application of different molecular markers in biotechnology. International Journal of Science Letters. 2020; 2(2); 98‒113. https://doi.org/10.38058/ijsl.770081

10. Hashim H.O., Al-Shuhaib M.B.S. Exploring the Potential and Limitations of PCR-RFLP and PCR-SSCP for SNP Detection: A Review. Journal of Applied Biotechnology Reports. 2019; 6(4): 137‒144. https://doi.org/10.29252/JABR.06.04.02

11. Ota M., Fukushima H., Kulski J.K., Inoko H. Single nucleotide polymorphism detection by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. Nature Protocols. 2007; 2(11): 2857–2864. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.407

12. Kuzhebaeva U.Zh., Donnik I.M., Petropavlovskiy M.V., Kanatbaev S.G., Nurgaliev B.E. Nitric oxide as an indicator for assessing the resistance and susceptibility of cattle to leukemia. Аграрный вестник Урала. 2021; (10): 48–54. https://doi.org/10.32417/1997-4868-2021-213-10-48-54

13. Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х., Шастин П.Н. Тестирование разработанного способа ПЦР-ПДРФ-генотипирования крупного рогатого скота по SNP-маркерам гена iNOS. Аграрная наука. 2024; (7): 74‒78. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2024-384-7-74-78

14. Hrubá M. dCAPS method: advantages, troubles and solution. Plant, Soil and Environment. 2007; 53(9): 417‒420. https://doi.org/10.17221/2293-PSE

15. Shendure J. et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 2017; 550(7676): 345‒353. https://doi.org/10.1038/nature24286

16. Li J., Makrigiorgos G.M. Anti-primer quenching-based real-time PCR for simplex or multiplex DNA quantification and single-nucleotide polymorphism genotyping. Nature Protocols. 2007; 2(1): 50‒58. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.11

17. Вафин Р.Р., Гильманов Х.Х. ДНК-технологии идентификации аллелей и генотипов полиморфных маркеров анализируемого локуса гена iNOS Bos taurus. Аграрная наука. 2025; (5): 89‒94. https://doi.org/10.32634/0869-8155-2025-394-05-89-94