Выделение и очистка рекомбинантного гексона бычьего аденовируса 3-го типа

Актуальность. Аденовирусы (Mastadenovirus, Adenoviridae) являются одним из превалирующих этиологических агентов комплекса респираторно-кишечных заболеваний КРС, занимая до 70% в нозологической структуре заболеваемости молодняка. Диагностика аденовирусной инфекции затруднена в связи с разнообразием серотипов. Наиболее широкое распространение в практике получил иммуноферментный анализ. Повысить чувствительность и специфичность метода возможно путем комплектации тест-систем очищенными рекомбинантными антигенами.

Методы. В работе применяли методы биоинформационного анализа и генной инженерии. Клонирование синтезированной вставки, кодирующей фрагмент гена гексона, осуществляли в вектор pET-22b(+), экспрессию проводили в организме E. coli. Для подбора условий очистки применяли классические методы дезинтеграции клеток в сочетании с металлхелатной аффинной хроматографией.

Результаты. С помощью классических методов биоинформационного анализа нуклеотидной последовательности штамма WBR-1 бычьего аденовируса 3-го типа была разработана эпитопная структура усеченного рекомбинантного гексона молекулярной массой 17,0 кДа, белок с гексагистидиновым тегом был синтезирован в прокариотической системе экспрессии штаммом-продуцентом E. coli BL21(DE3)pLysS/pET-22b(+)-Hexon в виде телец включения. Были подобраны оптимальные условия культивирования штамма и проведения металлхелатной хроматографической очистки на Ni-NTA сефарозе в денатурирующих условиях, что позволило получить электрофоретически гомогенный продукт. Были оптимизированы условия постановки непрямого иммуноферментного анализа на основе рекомбинантного гексона. Описанный в работе методический подход может быть применен для получения рекомбинантного гексона в качестве антигена для получения поликлональных или моноклональных антител против аденовируса 3-го типа, что более эффективно и экономично по сравнению с антигеном нативного вируса, культивируемого в клетках млекопитающих

1. Jesse S.T. et al. Molecular characterization of a bovine adenovirus type 7 (Bovine Atadenovirus F) strain isolated from a systemically infected calf in Germany. Virology Journal. 2022; 19: 89. https://doi.org/10.1186/s12985-022-01817-y

2. Vidovszky M.Z., Szeredi L., Doszpoly A., Harrach B, Hornyák Á. Isolation and complete genome sequence analysis of a novel ovine adenovirus type representing a possible new mastadenovirus species. Archives of Virology. 2019; 164(8): 2205‒2207. https://doi.org/10.1007/s00705-019-04299-6

3. Каримуллина И.Г. и др. Серологический мониторинг респираторных и желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота в молочных комплексах Приволжского федерального округа. Ветеринария Кубани. 2025; (2): 13‒15. https://www.elibrary.ru/cgebya

4. Яруллин А.И. и др. Оценка серопревалентности аденовирус ной инфекции крупного рогатого скота в некоторых животноводческих хозяйствах. Инновационные решения актуальных вопросов биологической и токсикологической безопасности. Матери алы Всероссийской научно-практической конференции с между народным участием. Казань. 2023; 214‒216. https://elibrary.ru/knzcne

5. Shemelkova G.O., Yuzhakov A.G., Zaberezhny A.D., Shemelkov E.V., Aliper T.I. Development of a test system for detecting bovine adenovirus DNA based on polymerase chain reaction. IOP Conference Series: Earth and Environmental Science. 2019; 315(4): 042027. https://doi.org/10.1088/1755-1315/315/4/042027

6. Гаффаров Х.З., Яруллин А.И., Гумеров В.Г., Каримуллина И.Г., Усольцев К.В. Аденовирусы крупного рогатого скота (обзор). Ветеринария. 2019; (11): 3‒8. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2019.22.11.03-08

7. Shen Y., Liu J., Zhang Y., Ma X., Yue H., Tang C. Prevalence and characteristics of a novel bovine adenovirus type 3 with a natural deletion fiber gene. Infection, Genetics and Evolution. 2020; 83: 104348. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104348

8. Li Q., He S., Zou Y., Yue H., Tang C., Liu J. Pathogenicity of a novel bovine adenovirus type 3 with a natural deletion partial fiber gene in BALB/c mice. Frontiers in Veterinary Science. 2023; 10: 1138159. https://doi.org/10.3389/fvets.2023.1138159

9. Mukantayev K.N., Tursunov K.A., Kanayev D.B., Tokhtarova L., Ramankulov Ye.M., Mukanov K.K. Obtaining strain-producer of recombinant hexon of bovine adenovirus type 3. Eurasian Journal of Applied Biotechnology. 2019; (1): 73‒84. https://elibrary.ru/wznmfh

10. Vaatstra B.L., Tisdall D.J., Blackwood M., Fairley R.A. Clinicopathological features of 11 suspected outbreaks of bovine adenovirus infection and development of a real-time quantitative PCR to detect bovine adenovirus type 10. New Zealand Veterinary Journal. 2016; 64(5): 308‒313. https://doi.org/10.1080/00480169.2016.1198280

11. Werid G.M. et al. Bovine adenovirus prevalence and its role in bovine respiratory disease complex: A systematic review and meta analysis. The Veterinary Journal. 2025; 310: 106303. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2025.106303

12. Lehmkuhl H.D., Smith M.H., Dierks R.E. A bovine adenovirus type 3: Isolation, characterization, and experimental infection in calves. Archives of Virology. 1975; 48(1): 39‒46. https://doi.org/10.1007/BF01320564

13. Gundegmaa U., Raadan O., Wu H.-C., Wang H.-Y., Wu M.-C., Chu C.-Y. Recombinant hexon protein as a new bovine adenovirus type 3 subunit vaccine candidate. Journal of Veterinary Research. 2023; 67(1): 23‒31. https://doi.org/10.2478/jvetres-2023-0014

14. Toogood C.I.A., Crompton J., Hay R.T. Antipeptide antisera define neutralizing epitopes on the adenovirus hexon. Journal of General Virology. 1992; 73(6): 1429‒1435. https://doi.org/10.1099/0022-1317-73-6-1429

15. Chiocca S., Kurzbauer R., Schaffner G. et al. The complete DNA sequence and genomic or organization of the ovian adenovirus CELO. J. Virol. 1996; 79: 2939–2949. https://elibrary.ru/vjtshr

16. Rossmanith W., Horvath E. Bovine adenoviruses. VI. An enzyme linked immunosorbent assay for detection of antibodies to bovine adenovirus types belonging to subgroups I and II. Microbiologica. 1988; 11(4): 387‒394.

17. Kulkarni D.D. et al. Development and Evaluation of Recombinant Nucleocapsid Protein Based Diagnostic ELISA for Detection of Nipah Virus Infection in Pigs. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 2016; 37(2): 154‒166. https://doi.org/10.1080/15321819.2015.1074922

18. Spencer K.-A., Osorio F.A., Hiscox J.A. Recombinant viral proteins for use in diagnostic ELISAs to detect virus infection. Vaccine. 2007; 25(30): 5653‒5659. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2007.02.053

19. Дятлова В.И. Применение методов обратной вакцинологии для разработки новых вакцин против бруцеллеза. Бактериология. 2021; 6(4): 16‒29. https://elibrary.ru/vswoqs

20. Мима К.А., Каторкина Е.И., Каторкин С.А., Цыбанов С.Ж., Малоголовкин А.С. In silico идентификация B- и T-клеточных эпитопов белка CD2v вируса африканской чумы свиней (African swine fever virus, Asfivirus, Asfarviridae). Вопросы вирусологии. 2020; 65(2): 103‒112. https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-103-112

21. Ахунова А.Р., Насыров Ш.М., Алеева З.З., Арутюнян Г.С., Галеева А.Г., Ефимова М.А. Получение рекомбинантного гликопротеина Erns вируса классической чумы свиней для DIVA совместимых тест-систем. Ветеринария Кубани. 2024; (6): 21‒23. https://elibrary.ru/gjstyb

22. Froger A., Hall J.E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. JoVE. 2007; (6): e253. https://doi.org/10.3791/253

23. Грудинин М.П. и др. Клонирование и экспрессия в E. coli рекомбинантного белка VP1 вируса инфекционной анемии птиц. Российский ветеринарный журнал. 2019; (2): 12‒20. https://doi.org/10.32416/article_5cd16d06b14db8.99635578

24. Grabski A., Drott D., Handley M., Mehler M., Novy R. Extraction and Purification of Proteins from E. Coli without Harvesting Cells. The Scientific World Journal. 2002; 2(1): 36‒38. https://doi.org/10.1100/tsw.2002.19

25. Park A.-R., Jang S.-W., Kim J.-S., Park Y.-G., Koo B.-S., Lee H.-C. Efficient recovery of recombinant CRM197 expressed as inclusion bodies in E. coli. PLOS One. 2018; 13(7): e0201060. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201060

26. Nekoufar S., Fazeli A., Reza Fazeli M. Solubilization of Human Interferon β-1b Inclusion Body Proteins by Organic Solvents. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 2020; 10(2): 233‒238. https://doi.org/10.34172/apb.2020.027

27. Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2005; 99(4): 303‒310. https://doi.org/10.1263/jbb.99.303

28. Kielkopf C.L., Bauer W., Urbatsch I.L. Bradford Assay for Determining Protein Concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020; 2020(4): 102269. https://doi.org/10.1101/pdb.prot102269

29. Галеева А.Г. и др. Экспрессия в E. Coli маркированного рекомбинантного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Международный вестник ветеринарии. 2024; (2): 49‒57. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.2.49

30. Николаева Ю.А. и др. Рекомбинантный нуклеопротеин вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней для серологи ческой диагностики. Ветеринарный врач. 2025; (2): 85‒93. https://elibrary.ru/sclvyp

31. Волосникова Е.А. и др. Получение растворимого интерферона гамма человека в системе экспрессии Escherichia coli при снижении температуры культивирования. Прикладная биохимия и микробиология. 2023; 59(2): 167‒173. https://doi.org/10.31857/S0555109923020174