Оценка жизнеспособности культур молочнокислых микроорганизмов при их замораживании и низкотемпературном хранении

Актуальность. Значительный рост микробиомассоциированных болезней, тесно связанных с нарушениями бактериального разнообразия и функций нормальной кишечной микробиоты, диктует необходимость разработки и осуществления мер по длительному сохранению отдельных представителей нормальной микробиоты с целью создания новых стратегий для модуляции состава микробиомов.
Методы. Изучено влияние технологии глубокого замораживания и хранения кишечных изолятов молочнокислых бактерий 2 таксономических групп, выделенных от птицы, в условиях Станции низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (ВКСМ) на среде культивирования MRS с использованием в качестве криоконсервантов 10 и 20% глицерина или 10 и 20% сахарозы. Взвеси изолятов замораживали при -150 °С в течение 18 час и затем размещали в автоматизированное криохранилище при -80 °С. Контроль образцов на сохранность живых клеток и функциональную активность культур молочнокислых бактерий проводили после замораживания при -150 °С перед помещением в криохранилище и далее в динамике хранения при температуре -80 °С через 4, 9 и 18 мес хранения.
Результаты. Технология криозамораживания молочнокислых бактерий на MRS-бульоне с использованием в качестве криоконсервантов 10 и 20% глицерина или 10 и 20% сахарозы, позволяет сохранять жизнеспособность, физиологические и биохимические свойства кишечных изолятов молочнокислых бактерий при хранении в течение 18 мес. Все использованные защитные среды (MRS -бульон с глицерином 10 и 20%, MRS-бульон с сахарозой 10 и 20%) показали сравнимые результаты по сохранности жизнеспособности и кислотообразующей активности изолятов Lactobacillus fermentum-2, Pediococcus pentosaceus 6п-3, Pediococcus pentosaceus 28п-1. Тогда хранение изолята Pediococcus pentosaceus (28п-1) в заданном параметре на защитной среде с 10 и 20% сахарозы привело к снижению активности кислотообразования.

1. Morris G. J. Cryopreservation: An Introduction to Cryopreservation in Culture Collections., Culture Centre of Algae and Protozoa, Cambridge, UK, 1981, 27p.

2. Polge C., Smith A. U. and Parkes A. S. Revival of Spermatozoa after Vitrification and Dehydration at Low Temperatures. Nature, 1949; vol. 164, (4172): p. 666.

3. Macfadyen A., Rowland S. Note on the influence of the temperature of liquid air on bacteria. The Lancet, 1900, vol. 155, (3999): p. 1130.

4. Похиленко В. Д., Баранов A. M., Детушев К. В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009; 4 (12): c. 99-121. [Pohilenko V. D., Baranov A. M., Detushev K. V. Methods of long-termstorage of collection cultures of microorganisms and development trends. Izvestiya visshih uchebnih zavedenii. Povoljskii region. Meditsinskie nauki. 20094 (12): p. 99-121 (In Russ.)]

5. Jahnelm F. Uber das Uberleben von Syphilis und Recurrensspirochaten sowie Sodukspirillen in flussigem Stickstoff (temperature -196o) und die Winwirkung anderer Kaltegrade auf diese. Mikroorganismen Klin. Wschr.1937; vol. 16: p.1304-1305 [Jahnelm F. About the survival of syphilis and recurring spirits as well as soda spirits in liquid nitrogen (temperature -196o) and the effect of other degrees of cold on them. Mikroorganismen Klin. Wschr.1937; vol. 16: p. 1304-1305 (In Germ)]

6. Morgan C. A., Herman N., White P. A., Vesey G. Preservation of micro-organisms by drying: A review. Journal of Microbiological Methods. 2006; vol. 66 (2): p. 183-193

7. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. Пер. с англ. О. Смит. М., 1963. 430 с.

8. The WFCC Guidelines for the Establishment and Operation of Culture Collections (Online). 2010.

9. Uzunova-Doneva T., Donev T. Anabiosis and conservation of microorganisms. J. of Culture Collections. 2005; (4): p. 17-28

10. NNI Cryopreservation manual. Nalge Nunc International Corp., Penfield, New York, USA. 1998.

11. Farrant J. General observations on cell preservation. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology, Pitman Medical Limited, Kent, England.1980; (1-18).

12. Бронштейн В. Л. К механизму взаимодействия растущих кристаллов льда с биологическими структурами при замораживании. Докл. АН СССР 1978; (3): p. 722-725 [Bronstein V. L. To the mechanism of the interaction of growing ice crystals with biological structures during freezing, Dokl. AN SSSR, 1978; (3): p. 722-725, (In Russ.)]

13. Safronova V., Tikhonovich I. Automated cryobank of microorganisms: Unique possibilities for long-term authorized depositing of commercial microbial strains. In: Microbes in applied research: current advances and challenges, 2012. Singapore, р. 331-334

14. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems. Science. 1970; (168): p. 939-949.

15. Mazur, P. Freezing of live cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984; (247): p. 125-142.

16. Elliott G. D., Wang S., Fuller B. J. Cryoprotectants: A review of the actions and applications of cryoprotective solutes that modulate cell recovery from ultra-low temperatures. Cryobiology. 2017; (76): p. 74-91

17. Leila B., Fabre-Gea C., Auriol D., J Blanc P. Study of the cryotolerance of Lactobacillus acidophilus: effect of culture and freezing conditions on the viability and cellular protein levels. J. of Food Microbiology. 2000; Vol. 59, (3): p. 241-247

18. Короткая Е. В. Исследование свойств криоконсервированных заквасок. Техника и технология пищевых производств. 2011; (1(20)): p.31-36. [Korotkaya E. V. Investigation of the properties of cryopreserved starter cultures. Tehnika I tehnologiya pischevih proizvodstv, 2011; (1(20)): p. 31-36 In Russ.)]

19. Baumann D. P., Reinbold G. W. Freezing of Lactic Cultures. J. of Dairy Sci. 1966; Vol. 49 (3): p. 259-264

20. Baati L., Fabre-Gea C., Auriol D., Blanc P. J. Study of the cryotolerance of Lactobacillus acidophilus: effect of culture and freezing conditions on the viability and cellular protein levels. J. Food Microbiol. 2000; 59(3): p. 241-7

21. Fonseca F., Beal C., Corrieu G. Operating conditions that affect the resistance of lactic acid bacteria to freezing and frozen storage. Cryobiology. 2001; 43(3):189-198.

22. Савкина О. А., Терновской Г. В., Локачук М. Н., Павловская Е. Н., Сафронова В. И. Криоконсервация перспективный метод хранения промышленно ценных штаммов молочнокислых бактерий и дрожжей. Сельскохозяйственная биология, 2014; (4): c. 112-119 [Savkina O. A., Ternovskii G. V., Lokachuk M. N., Pavlovskaya E. N., Safronova V. I. Cryopreservation is a promising method for storing industrially valuable strains of lactic acid bacteria and yeast. Sel'skohozyaystvennaya mikrobiologiya 2014; (4): p. 112-119, (In Russ.)]

23. Сидякина Т. М. Консервация микроорганизмов в коллекциях культур. Сб. научн. трудов «Консервация генетических ресурсов. Методы. Проблемы. Перспективы». АН СССР, Пущинский научн. центр. Институт биологической физики. Пущино.1991; с.81-159. [Sidiakina T. M. Conservation of Microorganisms in Culture Collections. Sbornik nauchnih trudov "Konservatsiya geneticheskih resursov. Metodi. Problemi. Perspektivi. AN SSSR, Puschinskii nauchnii centr. Institut biologicheskoi fiziki. Puschino 1991; p.81-159 (In Russ.)]

24. Ouwehend A. C., Salminen S., Isolauri E. Probiotics:an overview of benefcial effects. J. Microbiol. 2003; Vol. 41 (2): c. 63-72.

25. Новик Г. И. Сохранение жизнеспособности и физиологических свойств бифидобактерий при криоконсервации и лиофилизации. Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 5. - c. 637-642 [Novik G. I. Preservation of the viability and physiological properties of bifidobacteria during cryopreservation and lyophilization. Mikrobiologiya, 1998. - Т 67, № 5. - p. 637-642 (In Russ.)]

26. ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов. [GOST 10444.11-89 Food products. Methods for the determination of lactic acid microorganisms.]

27. ГОСТ 3624-92 Молоко и молочные продукты. Титриметрические методы определения кислотности. [GOST 3624-92 Milk and dairy products. Titrimetric methods for determining acidity]

28. Сафронова В. И. Комплексная характеристика и селекция клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae: Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Санкт-Петербург, 1994. 14 с. [Safronova V. I, Complex characterization and selection of nodule bacteria of the goat's rue Rhizobium galegae. Dissertatsiya na soiskanie uchenoi stepeni kandidata biologicheskih nauk, Sankt-Peterburg, 1994. 14 p. (In Russ.)]

29. Сафронова В. И., Оследкин Ю. С., Свиридова О. В., Воробьев Н. И. Методы консервации коллекционных культур микроорганизмов. СПб, 2007. [Safronova V. I., Osledkin U. S, Sviridova O. V., Vorob'yov N. I. Methods for the conservation of collection cultures of microorganisms, SPb, 2007 (In Russ.)]

30. Andersen Astrid B., Mette S. Fog-Petersen, Larsen H., Skibsted L. H. Storage Stability of Freeze-dried Starter Cultures (Streptococcus thermophilus) as Related to Physical State of Freezing Matri. Food Science and Technology. 1999;. Vol. 32 (8): p. 540-547.

31. Passot S., Rault A., Cenard S., Fonseca F. Cryopreservation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: Towards a quantitative understanding of the cell biophysical response during freezing. Cryobiology. 2010; Vol. 61 (3): 372.

32. Gibson C. A., Landerki G. B., Morse P. M. Effects of additives on the survival of lactic streptococci in frozen storage. Appl. Microbiol. 1966; (14): p. 665-669.